核糖核酸酶，白色粉末。為具有球蛋白性狀的一種蛋白質(zhì)。溶于水、50%丙酮。此酶最適宜溫度為60℃，85℃以上失去作用，最適宜的pH值為7.6。是催化核糖核酸水解的一種核酸內(nèi)切酶，可使胞嘧啶核酸解聚。對胸腺核酸則無作用。用于生化研究。
核糖核酸酶的分類：
（一）核糖核酸酶A
核糖核酸酶A（RNAseA）來源于牛胰臟，是一種內(nèi)切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵，反應終產(chǎn)物是3’嘧啶核苷酸和末端帶3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。無輔助因子及二價陽離子存在時，核糖核酸酶A的作用可以被胎盤RNA酶抑制劑（RNasin）或氧釩一核糖核苷復合物（vanadyl—ribonuclosidecomplex，VRC）所抑制。RNAseA的反應條件極廣，且極難失活。在低鹽濃度（0～100mmol/lNaCl）下，RNAseA切割單鏈和雙鏈RNA、DNA：RNA雜交體中的RNA；當NaCl濃度為300mmol/l?；蚋邥r，RNAseA就特異性切割單鏈RNA。去除反應液中的RNAseA，通常需要蛋白酶K處理、酚反復抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中，核糖核酸酶A的主要用途為：
①從DNA：RNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。
②確定RNA或DNA中的單堿基突變的位置。在RNA：DNA或RNA：RNA雜交體中，若存在單堿基錯配，可用RNAseA識別并切割。通過凝膠電泳分析切割產(chǎn)物的大小，即可確定錯配的位囂。
③RNA檢測。RNA酶保護分析法（RNAseprotectionassay）是近年來發(fā)展起來的一種檢測RNA的雜交技術(shù)。其基本原理是利用單鏈RNA探針，與待測的RNA樣品進行雜交形成RNA：RNA雙鏈分子，由于RNA酶可專一性地降解未雜交的單鏈RNA，而雙鏈受到保護不被降解，經(jīng)凝膠電泳可以確定目的RNA的長度。該方法靈敏度較Northern雜交法更高，并可進行較為準確的定量。選擇適當?shù)奶结?，還可進行基因轉(zhuǎn)錄起始位點分析及內(nèi)含子（也稱內(nèi)元）剪切位點分析等研究。此法的靈敏度比核酸酶S1保護分析法高數(shù)倍。
④降解DNA制備物中的RNA分子。須使用無DNAsd的RNAse（DNaseIfreeRNAse），市售的一般RNAseA常含有DNAse，可在100retool/ITris—CI（pH7．5）和15mmol/l。NaCI溶液中100℃加熱15min，以去除之。
（二）核糖核酸酶T1
核糖核酸酶T1（RNAseT1）來源于米曲霉（Aspergillusorjzae），它特異地作用于鳥嘌呤3’端磷酸，切割位點在鳥嘌呤的3’磷酸和相鄰核苷酸的5‘羥基之問的磷酸二酯鍵，反應終產(chǎn)物為3’鳥苷酸和末端帶3’鳥苷酸的寡核苷酸片段。RNAseTl的反應條件極廣，且極難失活，其催化活性類似于RNAseA。
在RNA酶保護實驗中，RNAseT1與RNAseA聯(lián)合使用，對RNA進行定量和作圖；還可用于去除DNA：RNA雜交體中未雜交的RNA區(qū)。
（三）核糖核酸酶H
核糖核酸酶H（RNAseH）最早是從小牛胸腺組織中發(fā)現(xiàn)的，其編碼基因已被克隆到大腸桿菌中。它能特異地降解DNA：RNA雜交雙鏈中的RNA鏈，產(chǎn)生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和單核苷酸，它不能降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。
在分子克隆中，核糖核酸酶H的主要用途是與大腸桿菌DNA聚合酶工和DNA連接酶一起參加cDNA克隆中第二條I）NA互補鏈的合成。當用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA第一鏈之后，用RNAseH部分消化mRNA：DNA雜交分子中的RNA，產(chǎn)生的RNA片段就像岡崎片段一樣，作為大腸桿菌DNA聚合酶T的引物，以cDNA第一鏈為模板合成DNA，直到把mRNA全部代替。然后在DNA連接酶的作用下，封閉缺口形成雙鏈cDNA。
掃一掃，關(guān)注微信
當前位置：